5-Aminofluoresceína

A 5-aminofluoresceína (também chamada de 5-AF ou Fluoresceinamina) é amplamente utilizada como reagente de marcação fluorescente. A amina primária da 5-aminofluoresceína pode reagir com grupos carboxila (por meio da ativação de EDC/NHS), aldeídos, cetonas ou ésteres ativados (por exemplo, ésteres de NHS) para formar ligações amida ou imina estáveis. Exibe um máximo de excitação em ~ 490 nm (λmax = 496 nm em tampão borato pH 8,5) e um máximo de emissão em ~ 515 nm, fornecendo um sinal verde brilhante com boa fotoestabilidade e um deslocamento de Stokes de cerca de 40 nm. A sua intensidade de fluorescência depende do pH, aumentando notavelmente em condições alcalinas (pH 8-9), o que é atribuído a alterações no estado de protonação do grupo amino.

A 5-aminofluoresceína encontrou ampla utilização em pesquisas biológicas e médicas – desde a rotulagem de proteínas e anticorpos até a construção de sistemas direcionados de administração de medicamentos e sensores fluorescentes. A 5-aminofluoresceína também é um intermediário chave na síntese do isotiocianato de fluoresceína (isômero I do FITC), um dos reagentes mais populares para marcação de proteínas.

Parâmetros do produto

Notas de preparação e armazenamento

O 5-AF é normalmente sintetizado a partir do ácido 4-nitroftálico, seguido de redução (por exemplo, com hidrazina/FeOOH) e condensação com resorcinol em ácido metanossulfônico. O produto bruto é uma mistura de isômeros 5 e 6, que são separados por cristalização. Os métodos modernos (assistidos por microondas ou enzimáticos) podem melhorar o rendimento e reduzir os subprodutos. A purificação final por HPLC garante pureza ≥95%, com estrutura confirmada por RMN e MS.

Armazenamento – O composto é sensível à luz, ar e umidade. Armazene em um recipiente selado e purgado com argônio a 4°C no escuro. Para armazenamento de longo prazo (>6 meses), recomenda-se -20°C na forma de pó (estável por pelo menos 3 anos). Soluções em DMSO podem ser armazenadas a -80°C por 6 meses ou a -20°C por 1 mês. Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. O transporte à temperatura ambiente é aceitável se protegido da luz e da umidade.

Perguntas frequentes (FAQ)

Q1: Qual é a diferença entre 5‑aminofluoresceína (5‑AF) e FITC? Como faço para escolher?

R: Ambos são corantes verdes fluorescentes, mas seus grupos reativos são diferentes.

● 5‑AF possui uma amina primária (–NH₂). Requer a ativação do grupo carboxila de um alvo (usando EDC/NHS) antes da conjugação. Melhor para rotular moléculas que já contêm um grupo carboxila.

● FITC possui um grupo isotiocianato (–N=C=S) que reage diretamente com aminas no alvo (por exemplo, resíduos de lisina em proteínas) – sem necessidade de ativação prévia. FITC é mais conveniente para rotulagem rotineira de proteínas.

● Escolha 5‑AF se precisar de uma conjugação específica e orientada (por exemplo, através de um cabo carboxílico) ou se planejar sintetizar derivados fluorescentes personalizados. FITC é geralmente mais simples para marcação direta de anticorpos.

Q2: Quais são as condições de reação típicas para marcação de biomoléculas com 5‑AF?

R: O método mais comum é o acoplamento de amida: ativar grupos carboxila na molécula alvo com EDC e NHS (em tampão MES ou PBS, pH 5,5–6,5), depois adicionar 5‑AF e ajustar para pH 7,5–8,5. Incubar à temperatura ambiente ou 37°C durante 2–4 horas. Para alvos contendo aldeído (por exemplo, glicoproteínas), use aminação redutiva com cianoborohidreto de sódio. O corante que não reagiu pode ser removido por dessalinização ou diálise. Uma proporção molar corante/proteína de 5:1 a 20:1 é um bom ponto de partida.

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