Cascatas biocatalíticas permitem a fabricação do peptídeo macrocíclico Enlicitide

O inibidor oral experimental de PCSK9 da MSD, o decanoato de enlicitida (MK-0616), é o primeiro inibidor oral de peptídeo macrocíclico PCSK9 a demonstrar redução substancial de LDL-C em humanos. O Enlicitide foi desenvolvido a partir de uma tela de exibição de mRNA de peptídeos monocíclicos e subsequentemente estabilizado através de ligações cruzadas não peptídicas para gerar uma estrutura compreendendo três macrociclos fundidos. Este octapeptídeo complexo contém seis aminoácidos não naturais e dois proteinogênicos conectados por 12 ligações amida e um ligante central de cadeia de seis carbonos. A síntese química tradicional requer 43 etapas, manipulações de grupos protetores (quase metade das etapas sintéticas), purificações cromatográficas e uma etapa de metátese de fechamento de anel catalisada por rutênio altamente diluída, limitando a escalabilidade e a sustentabilidade.

Desenvolvimento de Fabricação Quimioenzimática

Os cientistas do MSD desenvolveram um processo quimioenzimático conciso e convergente para fabricar decanoato de enlicitida (1) possibilitado pelo acoplamento direto de monômeros por ligases de aminoácidos, combinado com ligação de fragmentos peptídicos biocatalíticos e macrociclizações usando esterases e redutases de imina.

Principais conquistas

Montagem em cascata de três enzimas usando ligases de captura de ATP

- Cascata de três enzimas (duas ligases de captura de ATP projetadas + reciclagem de ATP) monta um tetrapeptídeo a partir de aminoácidos desprotegidos. Ligases de captura de ATP (especificamente ligases de aminoácidos dependentes de ATP, AALs) são enzimas que catalisam a formação de ligações amida entre aminoácidos ou peptídeos desprotegidos usando ATP como fonte de energia. Seu mecanismo ocorre através de um intermediário anidrido misto, que permite o acoplamento direto sem a necessidade de grupos protetores na amina nucleofílica ou em doadores de acila ativados. Neste estudo, os pesquisadores usaram uma ligase de controle ATP de Bifidobacterium adolescentis (BaAAL) e variantes projetadas (Trp-BaAALEng e Phe-BaAALEng) para estender seletivamente um dipeptídeo com dois aminoácidos não naturais (análogos de triptofano e fenilalanina) em uma cascata de um único recipiente. Essas ligases têm uma bolsa eletrofílica estreita e enterrada que aceita aminoácidos únicos como eletrófilos (substratos C-terminais), mas podem acomodar peptídeos mais longos como N-nucleófilos. Essa seletividade os torna ideais para montagem sequencial de peptídeos livres de grupos protetores do terminal C ao terminal N. O ATP consumido é reciclado usando uma polifosfato quinase (FbPPKWT) com hexametafosfato barato como doador de fosfato.

Macrolactamização regiosseletiva de esterase projetada (RsEstEng)

- A esterase projetada (RsEstEng) catalisa a macrolactamização regiosseletiva para formar o fragmento Northern (rendimento de 73%, escala de 52 kg). RsEstEng é derivado de uma carboxilesterase de tipo selvagem (RsEst) identificada em Roseibacillus sp. Sua função nativa é a hidrólise de ligações éster. Através da evolução dirigida, os investigadores converteram-no num catalisador para a macrolactamização regiosseletiva – a formação de uma ligação amida macrocíclica – na síntese do fragmento Northern (4) da enlicitida. Ele aceita o éster terc-butílico estável e volumoso do tetrapeptídeo linear (9) como doador de acila para produzir o peptídeo macrocíclico (4) para formar uma ligação amida intramolecular. Alcançou ciclização seletiva sem oligômeros detectáveis ​​e apenas 0,8% de subproduto de hidrólise de éster, mesmo sob condições de alta força iônica da cascata enzimática anterior.

Ligação intermolecular de tioesterase projetada (BlTEEng)

- A tioesterase projetada (BlTEEng) realiza ligação intermolecular dos fragmentos Norte (4) e Oriental (3) sem epimerização. BlTEEng é uma versão modificada de um domínio tioesterase (TE) originalmente excisado da peptídeo sintetase não ribossômica (NRPS) de Brevibacillus laterosporus (BlTE). As tioesterases de tipo selvagem em sistemas NRPS normalmente catalisam a macrociclização ou a liberação de peptídeos lineares de uma proteína transportadora através de uma ligação tioéster. As variantes projetadas de BlTE mostraram alguma atividade, mas favoreceram subprodutos diméricos. A engenharia enzimática mudou a enzima para catalisar a ligação intermolecular usando oxoésteres isopropílicos mais estáveis ​​em vez dos tioésteres naturais hidroliticamente lábeis.

Macrociclização de aminação redutiva em cascata de quatro enzimas

- A cascata de quatro enzimas (PsIREDEng, KsKREDEng e enzimas de reciclagem de cofatores StLDHWT, TvADHWT) atinge a macrociclização de aminação redutora para formar uma diamina bicíclica (rendimento de 69%, escala de 46 kg). KsKREDEng é uma cetorredutase projetada de Kyrpidia sp. Catalisa a oxidação de um composto de álcool benzílico (10) em um aldeído transitório (11) dependente de NAD+. PsIRED é uma imina redutase de Pseudogymnoascus sp. É dependente de NADPH. PsIREDEng catalisa a aminação redutiva do aldeído (11) e da amina existente para formar a imina cíclica (12), seguida pela redução ao macrociclo da amina secundária (13). StLDHWT regenera NAD+ para a etapa oxidativa, reduzindo o piruvato a lactato, enquanto TvADHWT regenera NADPH para a etapa redutora, oxidando o isopropanol em acetona.

Macrociclização final via PBP tioesterase projetada

- O acoplamento químico com o fragmento Western (2), seguido pela proteína tioesterase de ligação à penicilina projetada (SsPBP-TEEng), fecha o macrociclo final em alta concentração (70 g/L) – superando a limitação de diluição típica (5 g/L na síntese tradicional). O processo geral inclui três etapas em cascata, 7 enzimas projetadas + 3 enzimas auxiliares, rendimento geral de 39%, demonstração em escala de vários quilogramas, pureza >99%, sem cromatografia e sem grupos protetores. Este trabalho fornece um plano sustentável e escalável para a fabricação de peptídeos macrocíclicos complexos, reduzindo drasticamente a contagem de passos e o desperdício, ao mesmo tempo que melhora a eficiência e o acesso do paciente.